Assassin's Creed: Brotherhood продовжує історію з Assassin's Creed II. Гравці беруть на себе роль Еціо, коли використовують свої навички вбивць, щоб звільнити Рим і битися проти тамплієрів. Гравці беруть на завдання прогресувати історію, заробляти гроші і поступово звільняти місто від впливу Борджії. Зокрема, спалюючи тринадцять веж Борджія, які використовуються для забезпечення їхнього правління, Еціо може повернути собі частину Риму для людей і використати свої гроші на відновлення магазинів, швидкісних тунелів і навіть римських визначних пам'яток. Роблячи це, гравці також отримують регулярний дохід від Риму, який вони можуть вимагати в будь-якому з римських банків.
Новим для серії Assassin's Creed є багатокористувацька складова. Історія багатокористувацького режиму полягає в тому, що Абстерго, організація тамплієрів, використовує пристрої Animus, щоб навчити своїх новобранців стати Вбивцями. Ви берете на себе роль призовника Абстерго, і ви повинні знайти та вбити свою ціль, відслідковуючи самогубство. Ви повинні переконатись, що не викликаєте підозр, інакше стане очевидним, що ви вбивця, а не громадянин, що полегшить вас, щоб вас помітили та звалили. Граючи, ви заробляєте очки, які дозволяють вам підвищувати та вдосконалювати навички та здібності вашого персонажа.