Assassin's Creed: Brotherhood продолжает историю Assassin's Creed II. Игроки берут на себя роль Эцио, используя свои навыки убийцы, чтобы освободить Рим и сражаться с тамплиерами. Игроки выполняют миссии, чтобы продвигаться по сюжету, зарабатывать деньги и постепенно освобождать город от влияния Борджиа. В частности, сжигая тринадцать башен Борджиа, которые используются для обеспечения своего правления, Эцио может вернуть районы Рима для людей и использовать свои деньги для восстановления магазинов, коротких туннелей и даже римских достопримечательностей. Делая это, игроки также получают регулярный доход от Рима, который они могут запросить в любом из банков Рима.
Новое в серии Assassin's Creed - это многопользовательский компонент. Предыстория многопользовательского режима заключается в том, что Абстерго, организация тамплиеров, использует устройства Анимус, чтобы обучать своих новобранцев становиться ассасинами. Вы берете на себя роль новобранца Абстерго и должны найти и убить свою цель, при этом сами вас отслеживают на предмет убийства. Вы должны убедиться, что не вызываете подозрений, иначе станет очевидно, что вы наемный убийца, а не гражданин, что упростит для вас обнаружение и уничтожение. Во время игры вы зарабатываете очки, которые позволяют вам повышать уровень и улучшать навыки и способности вашего персонажа.