Дезмонда Майлза, останнього з роду стародавнього ордену асасинів, захопили сучасні нащадки тамплієрів і змусили пережити події минулого через пристрій під назвою "Анімус", щоб отримати важливу інформацію. Однак одна з учених несподівано переходить на бік тамплієрів і просить Дезмонда довіритися їй та піти за нею з комплексу. Незабаром вони тікають з місця ув'язнення і об'єднуються з новими союзниками, які мають намір використати знання Дезмонда проти тамплієрів. Їхній новий пристрій називається Анімус 2.0, це вдосконалена версія оригіналу. Цього разу Дезмонд переживає життя Еціо Аудиторе ді Фіренце, людини, яка жила в Італії у 15 столітті.
Еціо - галасливий, на перший погляд безтурботний юнак, який любить затівати бійки та ганятися за спідницями. Але все змінюється, коли його батька та молодшого брата публічно страчує людина, якій він довіряв. Спонукуваний жагою помсти, Еціо починає дізнаватися більше про життя свого батька і розуміє, що той теж належав до організації Асасинів. Еціо сам стає вправним ассасином і готовий піти до кінця, щоб помститися за смерть людей, яких він любив.
Assassin's Creed II - це екшен у вільному просторі, дуже схожий за концепцією та механікою гри на свою попередницю. Події гри відбуваються у Флоренції, Венеції, Римі та інших локаціях Італії. Окрім вигаданих персонажів, у грі присутні відомі історичні постаті того періоду, такі як Леонардо да Вінчі, Нікколо Макіавеллі, Чезаре Борджіа та інші, які відіграють активну роль у сюжеті гри. Автентичне культурне та політичне середовище італійського Відродження представлене в грі разом з вигаданими розповідями про події, альтернативною історією та метафізичними теоріями.
Основний ігровий процес нагадує попередню гру. Головний герой може вільно досліджувати кілька великих міст і сільських локацій пішки або верхи на коні. У грі також можна плавати і керувати човнами. Майже на кожну будівлю можна залізти, а протагоніст має доступ до найвищих дахів, спостерігаючи за панорамою за допомогою свого орлиного зору. Значну частину ігрового процесу займають стрибки та біг у вільній формі.
Одне з найпомітніших доповнень сиквелу - фінансова система, якої не було в першій грі. Предмети, зброю та обладунки можна купувати в крамницях та ремонтувати за гроші. У грі з'явилося набагато більше типів зброї та окремих видів зброї і обладунків. Еціо може носити мечі, кинджали, метальні ножі, димові шашки, пістолет і різноманітні види обладунків, які можна модернізувати. Зброю також можна підбирати з полеглих ворогів і використовувати в тій же битві. У різних куточках ігрового світу можна збирати багаті скарби.
У сиквелі з'явилися нові способи бути непомітним. Еціо може заплатити куртизанкам, щоб відволікти охоронців, найняти найманців для боротьби з ними або замовити злодіїв, щоб створити відволікаючий маневр. Цілі місій і, зокрема, кроки, необхідні для їх виконання, помітно різноманітніші, ніж у попередній грі. Протагоніст часто отримує нове спорядження та нові завдання, з якими можна поекспериментувати. Деякі з них побудовані як міні-ігри: наприклад, в один момент Еціо буде пілотувати літальний пристрій. У головного героя в грі є власна штаб-квартира, особняк і прилегле до нього невелике містечко. Є можливість вкладати гроші в реконструкцію містечка, а також кастомізувати особняк.
У грі значно більше побічних квестів, ніж у попередній частині. Серія підквестів передбачає пошук, збирання та розшифровку стародавніх слів мудрості, які нібито містять таємницю всесвіту. Ці квести часто передбачають проходження складного середовища критої платформи, щоб досягти мети. Ці послідовності вимагають точних стрибків і містять легкі елементи розв'язання головоломок, подібно до сучасних ігор "Принц Персії".