Дезмонд Майлз, последний представитель древнего ордена ассасинов, был захвачен современными потомками тамплиеров и вынужден переживать события прошлого с помощью устройства под названием "Анимус", чтобы получить важную информацию. Однако одна из ученых неожиданно меняет сторону и просит Дезмонда довериться ей и последовать за ней из комплекса. Вскоре после этого они сбегают из изолятора и объединяются с новыми союзниками, которые намерены использовать знания Дезмонда против тамплиеров. Их новое устройство называется Анимус 2.0, усовершенствованная версия оригинала. На этот раз Дезмонд переживает жизнь Эцио Аудиторе ди Фиренце, человека, жившего в Италии в 15 веке.
Эцио - шумный, внешне беззаботный молодой человек, который любит устраивать драки и гоняться за юбками. Но все меняется, когда его отца и младшего брата публично казнят по приказу человека, которому он доверял. Движимый жаждой мести, Эцио начинает узнавать больше о жизни своего отца и понимает, что тот тоже принадлежал к организации ассасинов. Эцио сам становится искусным ассасином и готов идти до конца, чтобы отомстить за смерть людей, которых он любил.
Assassin's Creed II - это экшен со свободным прохождением, очень похожий по концепции и механике геймплея на своего предшественника. События игры происходят во Флоренции, Венеции, Риме и других местах Италии. Помимо вымышленных персонажей, в игре присутствуют известные исторические личности того времени, такие как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Чезаре Борджиа и другие, которые играют активную роль в сюжете игры. Аутентичная культурная и политическая среда итальянского Возрождения представлена в игре наряду с вымышленными рассказами о событиях, альтернативной историей и метафизическими теориями.
Основной геймплей напоминает таковой в предыдущей игре. Главный герой может свободно исследовать несколько больших городов и сельских местностей пешком или верхом на лошади. В игре также можно плавать и управлять лодками. Почти на каждое здание можно забраться, а главный герой может забраться на самые высокие крыши, наблюдая за панорамой с помощью своего орлиного зрения. Прыжки и бег в свободной форме занимают значительную часть игрового процесса.
Одним из самых заметных дополнений сиквела является финансовая система, которой не было в первой игре. Предметы, оружие и броню можно покупать в магазинах и ремонтировать за деньги. В игре гораздо больше типов оружия и отдельных видов оружия и доспехов. Эцио может носить мечи, кинжалы, метательные ножи, дымовые шашки, пистолет и различные виды брони, которые можно улучшать. Оружие также можно подбирать с павших врагов и использовать в том же бою. В различных местах игрового мира можно собрать множество сокровищ.
В сиквеле появились новые способы скрытности. Эцио может заплатить куртизанкам, чтобы отвлечь стражу, нанять наемников, чтобы сразиться с ними, или поручить ворам создать отвлекающий маневр. Цели миссий и особенно шаги, необходимые для их выполнения, заметно разнообразнее, чем в предыдущей игре. Главный герой часто получает новое снаряжение и новые задачи, с которыми ему предстоит экспериментировать. Некоторые из них построены как мини-игры: например, в какой-то момент Эцио будет управлять летательным аппаратом. У главного героя в игре есть своя штаб-квартира - особняк и небольшой городок, прилегающий к нему. Можно вкладывать деньги в реконструкцию города, а также настраивать особняк.
В игре значительно больше побочных заданий, чем в ее предшественнице. Серия подзаданий включает в себя поиск, сбор и расшифровку древних слов мудрости, в которых, предположительно, содержится секрет вселенной. Эти задания часто связаны с преодолением сложного внутреннего платформенного окружения, чтобы достичь цели. Эти последовательности требуют точных прыжков и содержат легкие элементы решения головоломок, как и современные игры серии Prince of Persia.