Дія Resident Evil: Zero відбувається до подій оригінальної Resident Evil. Ви берете на себе роль одного з двох персонажів: Ребекки Чемберс, медика команди Браво, з якою ми зустрічалися в першій грі, і Біллі Коена, колишнього ув'язненого, якого перевозять. Гра починається з того, що команда Браво пролітає над землею, прямуючи розслідувати серію вбивств. Щось трапляється, і вертоліт розбивається. Всі виживають, але коли всі починають пошуки, вони стикаються з перекинутою військово-транспортною вантажівкою, всередині якої немає нічого, крім трупів. Ребекка Чемберс, наймолодший член команди S.T.A.R.S. Альфа, відправляється на розслідування розкішного поїзда компанії "Амбрелла", який таємничим чином зупинився посеред лісу. Тепер ви берете під свій контроль Ребекку, і ваша подорож починається.
На додаток до традиційного для серії геймплею в жанрі survival horror, гра вводить так звану систему "партнерського розряду", яка дозволяє в будь-який момент перемикатися між Ребеккою і Біллі. Цією функцією необхідно користуватися час від часу, оскільки гра вимагає від обох персонажів спільної роботи для вирішення деяких головоломок. Новими в грі є купа жахливих ворогів, таких як мутант-сороконіжка, нові області для дослідження і можливість кидати предмети на землю замість того, щоб шукати коробку з предметами.
На відміну від оригінальної версії для GameCube, всі оновлені порти пізніше включають додатковий режим Wesker, який відкривається після проходження гри. Цей режим додає два нових костюми: Ребекки з червоними очима та Біллі з певними особливими здібностями для Вескера. Обидва скіни, схоже, були засновані на Вескері та Джилл з Resident Evil 5, які з'явилися після виходу цієї гри на GameCube.