У 2012 році, здавалося б, звичайний бармен на ім'я Десмонд Майлз викрадений загадковою організацією. Викрадачі приєднують Десмонда до дивного пристрою під назвою "Анімус", який дозволяє йому отримати доступ до пам'яті свого предка, вбивці на ім'я Альтаїр. Чомусь реконструкція пам’яті Альтаїра є життєво важливою для викрадачів.
Після доступу до пам’яті Альтаїра Десмонд може пережити події, що відбулись у Святій Землі в 1191 році, час Третього хрестового походу. Аль Муалім, лідер вбивць, наказує Альтаїру вбити дев'ять видатних історичних діячів, які нібито дозволили війні та корупції опанувати Святу Землю.
Протягом більшої частини гри гравець контролює Альтаїр; проте чітко вказується, що контроль над ним є частиною досвіду Десмонда. Гравець також може контролювати Десмонда між його сесіями в "Анімусі".
Найбільш інноваційною особливістю гри є свобода вибору та пересування. Кожна архітектурна деталь, така як віконні виступи, різьблення в камені або дерев'яні решітки, може бути використана для переміщення по стінах. Це дозволяє гравцеві мати інтенсивні сцени погоні, якщо випадково вас охотить охоронець.
Є кілька способів досягти своєї мети у грі. Використовуючи підслуховування, допит та кишенькові злодії, ви можете дізнатись інформацію про свою наступну ціль. Потім ви можете використовувати цю інформацію, щоб вибрати, чи будете ви вражати цілі повним фронтальним штурмом або правильно встановленим метальним ножем з кришки дахів.
Залежно від вашого вибору, вам доведеться мати справу з громадянами та лицарями міст, які стануть підозрілими в плащі, що дивується на дахах або поблизу цілей місії. Є кілька ситуацій, коли ви можете змішатися серед натовпу, якщо вам пощастить, ви зможете вивести свою ціль, не дивлячись ні на кого. Алтаїр має невеликий, але ефективний арсенал зброї, такий як мечі та метальні ножі, і він може навчитися новим бойовим навичкам, щоб допомогти йому у виконанні своєї місії.