Хотя Spider-Man: Web of Shadows имеет некоторые общие черты с предыдущими играми о Человеке-пауке, в ней также есть много отличий, в том числе отсутствие связи с фильмом.
Во флешбеке в начале игры показано, как во время схватки с Веномом к Человеку-пауку прикрепляется симбионт, придающий ему большую силу. Затем Человек-паук встречает Люка Кейджа, который помогает обучить его побеждать городские банды. Во время попытки спасти лидеров банд от убийц, Человек-паук подвергается нападению жителей, которые находятся под контролем симбионта. Симбионт терроризирует город, распространяясь и прикрепляясь к невинным жителям. Человек-паук начинает поиски спасения Нью-Йорка.
Он видит, как эпидемия захлестывает улицы внизу, и с огромной скоростью и ловкостью проносится над зданиями и между ними, выслеживая злодеев. Не бойтесь падать со зданий, так как Человек-паук, похоже, не пострадает от падения. Когда на вас нападают, нажатие кнопки X позволяет Человеку-пауку наносить удары и побеждать. У игрока есть возможность легко менять костюмы, в которых вы можете победить плохих парней как красный Спайди, используя свою паутину, или черный Спайди, используя усики симбионта. Другие разрушительные комбо-атаки одинаковы независимо от цвета костюма. Выбор одного цвета костюма в пользу другого - это скорее личный выбор игрока для каждого боя, который не влияет на исход игры. Однако в ходе игры игроку придется принимать решения, равнозначные морали Человека-паука в красном или черном костюме. Выбор, сделанный в эти моменты, приведет игрока к различным концовкам в зависимости от выбранного пути. Очки зарабатываются по мере борьбы с преступностью и продвижения вперед, что помогает улучшать приемы и действия.