Crash Twinsanity отличается от предыдущих частей серии свободным перемещением по игровому пространству; игрок может исследовать окружающую среду во всех направлениях и плавно перемещаться между уровнями. В отличие от формата "центральная комната", использовавшегося в предыдущих играх, продвижение игрока по Twinsanity зависит от сюжета. На протяжении игры игрок управляет тремя разными персонажами: Крэшем Бандикутом, доктором Нео Кортексом (или обоими одновременно) и новым персонажем Ниной Кортекс; управляемый персонаж чередуется между определенными уровнями. Крэш - основной персонаж, он может подпрыгивать в воздух и приземляться на врагов, вращаться подобно торнадо, чтобы выбить врагов с экрана, скользить по земле и делать body slam, чтобы разбить определенные объекты. Кортекс вооружен лучевым пистолетом с ограниченным количеством патронов, а Нина использует свои механические руки, чтобы бить врагов и цепляться за дальние выступы. Когда Крэш и Кортекс вместе, Крэш может использовать Кортекса для увеличения дальности своей атаки вращением, использовать голову Кортекса как молот, чтобы разбивать определенные предметы, и бросать Кортекса через пропасти, чтобы активировать переключатели. На двух уровнях игры используется стиль игры "HumiliSkate", в котором Крэш катается на Кортексе как на самодельном сноуборде, а на двух других - стиль игры "Doc Amok", в котором Крэш расчищает путь для убегающего Кортекса. Еще один стиль игры, названный "RollerBrawl", предполагает, что игрок управляет Крэшем и Кортексом на уровне, пока они участвуют в драке.
Через три года после своего предыдущего поражения от Крэша в игре Crash Bandicoot: The Wrath of Cortex, доктор Нео Кортекс возвращается на острова Вумпа, чтобы отомстить Крэшу. Кортекс выводит из строя сестру Крэша, Коко, и выдает себя за нее, чтобы заманить Крэша в ловушку. После победы Крэша над Кортексом и его Меха-Бандикутом Кортекс и Крэш падают в дыру и оказываются в пещере. Разъяренный своим поражением, Кортекс нападает на Крэша, и они вступают в затяжную схватку в пещере. Вернувшись на поверхность, Крэш и Кортекс сталкиваются с парой межпространственных попугаев по имени Злые Близнецы, которые планируют уничтожить острова Вумпа и украсть мозг Кортекса. После того как Кортекс обращается за помощью к Крэшу, на него спонтанно нападают пчелы, и он попадает в плен к папуасу Папу и его подчиненным соплеменникам, забредя на их территорию. Крэш спасает Кортекса из плена и спасается от преследующей его толпы соплеменников. Крэш и Кортекс снова сталкиваются со Злыми Близнецами, которые оживляют статую божества, чтобы напасть на пару. Кортекс, узнав, что злые близнецы пришли из Десятого измерения, придумывает план и зовет Крэша в свое антарктическое логово.