Игровой процесс стандартен для серии Assassin’s Creed и является развитием игрового процесса Assassin's Creed II. Как и в предыдущих частях, основой механики игры является паркур, использование толпы и различных укрытий для незаметных убийств и развитой системы ближнего боя. Открытый мир игры представляет некоторую степень нелинейности прохождения, хотя основные сцены игры и её хронологические рамки выстроены с помощью системы скриптов. Непосредственное прохождение сюжетной линии занимает около 15 часов. Кроме того, к игрокам вернулась возможность переигрывать все сюжетные миссии игры.
Действие игры преимущественно происходит в Риме XVI века, однако периодически события переносятся в наше время, где главным героем является Дезмонд Майлс, обучающийся искусствам ассасина с помощью машины «Анимус 2.0», позволяющей считывать генетическую информацию о предках Дезмонда и погружать его в прошлое. Главный герой исторической части игры — Эцио Аудиторе да Фиренце, один из лидеров и наставников ордена ассасинов. Злейшие враги ассасинов — представители влиятельного клана Борджиа, полностью контролирующие политику Рима и его коррумпированных лидеров.
По сравнению с предшествующей игрой, боевая система не претерпела серьёзных изменений. По словам разработчиков, динамика боя стала более активной и наступательной. Теперь поощряется быстрое наступление; контратаки стали менее эффективными. Система поведения неигровых персонажей стала агрессивной, игрока атакуют сразу несколько противников. Увеличилось количество оружия, появилась возможность использовать стационарные пушки в некоторых игровых ситуациях. Кроме того, серьёзно пересмотрена роль лошади, на которой теперь можно передвигаться и в пределах города. Лошадь участвует в некоторых элементах паркура.
В процессе выполнения заданий Эцио встречает и взаимодействует с различными историческими персонажами, такими как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Катерина Сфорца; представители рода Борджиа являются основными противниками игры. Сюжет игры в целом чётко вписан в хронологические рамки.